Capítulo 14. La manipulación de la información genética

La tecnología del DNA recombinante

1. La tecnología del DNA recombinante es un conjunto de técnicas que permiten analizar y manipular la información genética. Su aparición revolucionó la forma de estudiar la estructura y función de los genes. También posibilitó una nueva comprensión de la salud humana, al permitir el diagnóstico preciso de las enfermedades hereditarias.

Fig. 14-1. La tecnología del DNA recombinante

Las herramientas moleculares y las numerosas técnicas para manipular el DNA permiten cortar y pegar fragmentos de material genético, insertarlos en vectores que los transportan a los hospedadores deseados y posteriormente localizar, secuenciar y modificar esos fragmentos de ácidos nucleicos. El uso combinado de las herramientas permite obtener clones moleculares -poblaciones de células con construcciones genéticas homogéneas-, que posibilitan el estudio de los genes en distintos sistemas y la expresión de proteínas recombinantes específicas.

Las herramientas del oficio

2. Las principales herramientas de la tecnología del DNA recombinante son las enzimas que intervienen en la síntesis y degradación de los ácidos nucleicos (polimerasas, transcriptasas inversas, ligasas y nucleasas). Las enzimas de restricción son un grupo de endonucleasas que reconocen y cortan secuencias específicas de nucleótidos.

3. La materia prima habitual de la tecnología del DNA recombinante está constituida por el DNA de origen, los nucleótidos y los oligonucleótidos. Los oligonucleótidos sintéticos se obtienen en condiciones de laboratorio, por unión sucesiva de nucleótidos en un orden intencionalmente predeterminado.

4. Los vectores son moléculas de DNA en las que se inserta el DNA de interés para que se mantenga y se replique en las células hospedadoras. En general, tienen un tamaño pequeño y cuentan con un origen de replicación, un sitio de clonado y marcadores de selección. Los principales vectores son plásmidos, bacteriófagos y cósmidos.

5. Los hospedadores son células en las que se introducen los vectores que llevan el DNA de interés. Los hospedadores más usados son las bacterias Escherichia coli y Bacillus subtilis, la levadura Saccharomyces cerevisiae y las células CHO obtenidas de los ovarios de hámsters chinos.

Las técnicas para manipular el DNA

6. La hibridación consiste en desnaturalizar el DNA e incubarlo con sondas moleculares. Estas sondas son fragmentos cortos y de una sola cadena de DNA o RNA, marcados con átomos radiactivos. Las sondas se aparean con secuencias específicas, que permiten la identificación de un fragmento determinado de DNA que forma parte de una molécula mucho mayor.

Fig. 14-9. Técnica de hibridación de colonias

(a) Se parte de una mezcla de bacterias recombinantes que portan distintos fragmentos de DNA exógeno, entre ellos el fragmento que interesa localizar y un marcador que confiere resistencia a un antibiótico determinado. (b) Se distribuye la muestra en una placa de Petri con un medio de cultivo sólido que contiene el antibiótico de selección. Sólo las bacterias que hayan adquirido el plásmido recombinante crecerán formando colonias aisladas. Cada colonia se origina por divisiones sucesivas de una única bacteria inicial y todas las células de una colonia son idénticas. Por lo tanto, contienen el mismo plásmido recombinante, es decir, constituyen un clon. (c) Por medio de la aplicación de un filtro de nitrocelulosa que se pone en contacto con la superficie de la placa de Petri, bacterias de cada una de las colonias se transfieren al filtro (técnica de blotting) y se forma una réplica. (d) La réplica se trata con una solución alcalina que rompe las células y desnaturaliza el DNA del plásmido. El DNA se une químicamente al filtro. (e) El filtro con el DNA desnaturalizado se incuba en una solución que contiene sondas radiactivas (moléculas de DNA o RNA de cadena simple, complementarias al fragmento de DNA de interés). Se deja que las sondas hibriden. (f) Se lava del filtro el exceso de solución que contiene las sondas que no han hibridado. Las moléculas de cadena doble que se hayan formado permanecen en su lugar en el filtro y se visualizan por medio de autorradiografía. En esta técnica, cada filtro se cubre con una película fotográfica y se deja en la oscuridad. Durante el período de exposición, el radioisótopo presente en las sondas radiactivas libera energía que impacta la emulsión fotográfica. Cuando se revela la película, la posición del fragmento radiactivo aparece como una marca oscura, como cuando se expone un sector de película a la luz. Las réplicas de las colonias que estén marcadas con la sonda radiactiva después de este tratamiento permiten identificar a las colonias originales que contenían vectores con el fragmento de DNA que se deseaba estudiar.

7. Secuenciar el DNA es determinar el orden en que se encuentran en la molécula los nucleótidos que la constituyen. El método más usado en la actualidad es el de Sanger, que se basa en procedimientos enzimáticos. Existen aparatos que lo realizan en forma automática.

Fig. 14-14. Secuenciación del DNA por el método de Sanger

Se parte de un fragmento de DNA de cadena simple de secuencia desconocida. Un cebador marcado radiactivamente se aparea con el fragmento de DNA luego de lo cual la DNA polimerasa inicia la síntesis de la cadena complementaria. La mezcla en la que se producirá la reacción de síntesis se separa en cuatro tubos, cada uno de los cuales contiene, además de las enzimas y el cebador, los cuatro nucleótidos usuales y uno de cuatro nucleótidos "terminadores" (ddATP, ddCTP, ddGTP o ddTTP) en baja proporción. Los terminadores son didesoxinucleótidos (carecen del OH^- en la posición 3') por lo que, una vez que se agregan a la cadena que se está sintetizando, no pueden unirse con ningún otro nucleótido y frenan la síntesis, transformándose así en el último nucleótido de la cadena. Los productos de reacción se siembran luego en la parte superior de un gel, en "calles" separadas. Luego de la aplicación de la corriente eléctrica y una vez finalizada la corrida electroforética, se realiza la autorradiografía del gel. A la derecha de la fotografía del gel se muestra una porción aumentada en la que se señalan las posiciones de los fragmentos de DNA. De las posiciones se puede "leer" la secuencia de nucleótidos desconocida siguiendo un simple procedimiento. Primero se busca en qué calle se encuentra el fragmento que más lejos migró. Éste es el fragmento de menor tamaño e indica el primer nucleótido de la secuencia. En el ejemplo, este fragmento se ubica en la calle correspondiente a la guanina por lo que deducimos que la secuencia comienza con guanina. Luego se busca en qué calle se ubica el fragmento siguiente en tamaño, el de dos nucleótidos, lo que nos indica la identidad del segundo nucleótido de la secuencia. En este ejemplo, se trata nuevamente de guanina. Así se procede ubicando los demás fragmentos y se deduce la secuencia de nucleótidos complementaria a la cadena incógnita. En este ejemplo se trata de GGACAATTGT.

8. La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) permite obtener millones de copias de una molécula de DNA a partir de una muestra muy pequeña, sin necesidad de usar células vivas.

Fig. 14-16. Las aplicaciones de la PCR

Desde la creación de la técnica de PCR, sus aplicaciones se multiplican día a día y su gran versatilidad promete más y nuevos usos en los más diversos campos de la biología y la medicina.

Las técnicas y las herramientas en acción

9. La clonación molecular permite obtener una gran cantidad de copias de un fragmento de DNA usando células vivas. El procedimiento consiste en aislar un fragmento de DNA, insertarlo en un vector e introducirlo en un hospedador que luego se deja crecer. De esa manera se obtiene una población genéticamente homogénea (clon) en la que cada célula posee múltiples copias del fragmento de DNA en cuestión.

10. Las bibliotecas genómicas son colecciones de fragmentos de DNA clonados en vectores. En conjunto, cada colección representa el genoma total de un organismo. También existen bibliotecas de cDNA, obtenidas a partir de todo el mRNA presente en una célula en un momento dado.

11. Cuando se desea expresar un gen inserto en un vector, se usan vectores de expresión. Estas construcciones moleculares poseen secuencias que dirigen la transcripción y la traducción del gen que portan.

Las aplicaciones de la biotecnología moderna

12. El término biotecnología se refiere a la producción de "bienes y servicios" por medio de procesos que utilizan organismos, sistemas o procesos biológicos.

13. El análisis in vitro de la expresión génica facilita el estudio de proteínas que son escasas en condiciones naturales. También permite estudiar la respuesta de células modificadas frente a distintas condiciones experimentales.

14. Las proteínas recombinantes han adquirido una gran importancia económica (por ejemplo, en la producción de enzimas para la elaboración de quesos y papel) y sanitaria (producción de vacunas, hormonas y moléculas relacionadas con la respuesta inmunitaria).

15. Los campos de aplicación de los microorganismos recombinantes aumenta día a día, y ya se usan para producir polímeros biodegradables y biorremediar ambientes contaminados.

16. Los organismos transgénicos son aquellos en los que se ha introducido información genética ajena a su genoma. Los animales transgénicos han permitido, entre otras cosas, estudiar los efectos de inactivar o reemplazar un gen. Las plantas transgénicas resistentes a herbicidas o al ataque de insectos han encontrado rápida aplicación a nivel productivo. También se han obtenido plantas que producen niveles altos de vitamina A o aceites con composiciones específicas de ácidos grasos. Otras plantas transgénicas se usan como biorreactores para la expresión de proteínas de uso farmacéutico.

17. Actualmente, en bancos de datos accesibles por Internet se pueden consultar las secuencias de una enorme cantidad de genes y otras regiones de DNA de decenas de miles de organismos. También se conocen las secuencias completas de varios genomas de microorganismos, plantas y animales, incluida la especie humana.

18. El silenciamiento del RNA es un mecanismo de represión muy difundido y conservado en la naturaleza que consiste en la destrucción del RNA. Su utilización in vitro ha permitido silenciar genes asociados con ciertas funciones celulares y con procesos relacionados con el cáncer.

Algunos cuestionamientos éticos

19. La preocupación por los alcances de la manipulación genética no ha dejado de crecer desde los primeros experimentos en esta área del conocimiento. En varios países se han creado comités formados por representantes de distintos estratos de la sociedad, pero su influencia está limitada por las fuerzas políticas y económicas.